¿Cuáles son los métodos habituales de extracción y purificación de ácidos nucleicos que se utilizan en el diagnóstico in vitro?
El diagnóstico in vitro se refiere a productos y servicios que obtienen información de diagnóstico clínico al analizar muestras humanas (sangre, fluidos corporales, tejidos, etc.) fuera del cuerpo humano para determinar enfermedades o funciones corporales.
Uno de los pasos clave en la detección de muestras humanas es la purificación de ácidos nucleicos (ADN y ARN) en la muestra. El método de purificación de ácidos nucleicos es un factor importante que afecta la calidad del ácido nucleico extraído, y solo el ácido nucleico de alta calidad puede cumplir con varias aplicaciones posteriores.
El ácido nucleico es la base de la biología molecular, y la extracción de ácido nucleico es un umbral para la detección de ácido nucleico, e incluso toda la industria molecular no puede eludir el umbral. En muchos casos, la calidad de la extracción de ácido nucleico de una muestra determina directamente la validez de los resultados de la prueba.
Conocimientos básicos de ácido nucleico.
El ácido nucleico se divide en ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN), entre los cuales el ARN se puede dividir en ARN ribosómico (ARN r), ARN mensajero (ARN m) y ARN de transferencia (ARN t) según diferentes funciones.
El ADN se concentra principalmente en el núcleo, las mitocondrias y los cloroplastos, mientras que el ARN se distribuye principalmente en el citoplasma.
¿Por qué es necesaria la extracción de ácido nucleico?
La extracción de ácidos nucleicos proporciona respuestas a una gran cantidad de investigaciones y aplicaciones extensas, y el ácido nucleico obtenido se puede utilizar de diversas formas. El propósito exacto de la investigación determina el tipo de ácido nucleico que se extraerá; la aplicación de ácido nucleico a menudo afecta la elección del método de extracción. Para determinar el mejor método de investigación, es necesario tener una comprensión clara de las aplicaciones posteriores de los ácidos nucleicos y cualquier limitación potencial relacionada con el tipo de muestra. Aunque el método de lisis celular es diferente según el tipo de muestra, el principio básico de la extracción de ácido nucleico general sigue siendo el mismo: las muestras de células o tejidos se lisan para eliminar contaminantes que no son ácidos nucleicos.
Principios y requisitos de la extracción y purificación de ácidos nucleicos.
1. Asegurar la integridad de la estructura primaria del ácido nucleico;
2. Eliminar la contaminación de otras moléculas (como eliminar la interferencia de ARN al extraer ADN);
3. No hay disolventes orgánicos y concentraciones excesivamente altas de iones metálicos que puedan inhibir las enzimas en las muestras de ácido nucleico;
4. Debería minimizarse la contaminación de otras macromoléculas biológicas como proteínas, polisacáridos y moléculas lipídicas;
5. Eliminar la contaminación de otras moléculas de ácido nucleico, como eliminar el ARN al extraer moléculas de ADN, y viceversa.
Métodos habituales de extracción y purificación de ácidos nucleicos
1. Método de extracción de fenol y cloroformo
El fenol y el cloroformo se utilizan para extraer ADN mediante el uso de fenol como desnaturalizante de proteínas. La extracción repetida desnaturalizará la proteína. El SDS (dodecilsulfonato de sodio) lisará la membrana celular y digerirá la proteína o polipéptido o péptido pequeño en presencia de proteinasa K y EDTA. Las moléculas, desnaturalizan y degradan la proteína nuclear, liberando el ADN de la proteína nuclear. Mientras que el ADN es fácilmente soluble en agua, pero insoluble en disolventes orgánicos. La superficie de las moléculas de proteína tiene grupos hidrófilos, que también son fáciles de hidratar, y se forma una capa de hidratación en la superficie, de modo que las moléculas de proteína pueden ingresar suavemente a la solución acuosa para formar una solución coloidal estable.
Cuando existe la solución orgánica, la estabilidad coloidal de la proteína se destruye, desnaturaliza y precipita. Después de la centrifugación, el disolvente orgánico está en el fondo del tubo de ensayo (fase orgánica), el ADN está en la fase acuosa superior y la proteína se precipita entre las dos fases. Utilizando el principio de extracción, de acuerdo con el ácido nucleico proteico disuelto en diferentes capas de reactivo, la punta de la pipeta se extiende a las diferentes capas líquidas para extraer los componentes requeridos, y el ácido nucleico purificado se obtiene después de múltiples lavados.
La desventaja es que debido al uso de fenol, cloroformo y otros reactivos, la toxicidad es relativamente alta, la operación a largo plazo tiene un mayor impacto en la salud del personal, la tasa de recuperación de ácido nucleico es baja y la pérdida es grande. Debido al gran sistema operativo, la repetibilidad de la operación de diferentes experimentadores es pobre. No es propicio para proteger el ARN y es difícil realizar operaciones de miniaturización.
La ventaja es que utiliza reactivos y medicamentos comunes en los laboratorios y el costo es relativamente bajo.
2. Purificación de la columna de centrifugado
Este método utiliza la superficie del ácido nucleico para cubrirla con una película delgada compuesta de moléculas de agua. En un entorno con alto contenido de sal, esta membrana hidrófila se destruirá para que el ácido nucleico pueda adsorberse en la columna de rotación, mientras que otras impurezas, como proteínas y productos del metabolismo, etc., se separarán del ácido nucleico mediante precipitación centrífuga.
Pero aun así, el método de purificación de la columna de centrifugación todavía tiene deficiencias:
(1) Muy dependiente de la capacidad de unión de la membrana de adsorción;
(2) La elución incompleta conduce a la pérdida de ácido nucleico;
(3) El ácido nucleico no se puede extraer en grandes cantidades.
3. Método de perlas magnéticas para la tecnología de separación de ácidos nucleicos
Las perlas magnéticas cargadas positivamente son fáciles de adsorber ácidos nucleicos cargados negativamente y se utilizan principalmente para extraer ADN y ARN de muestras de suero o plasma humano. En términos generales, la muestra se mezcla con el tampón de unión y perlas magnéticas. Después de que el ácido nucleico se combina con las perlas magnéticas, el campo magnético lo lava y captura varias veces. El ácido nucleico eluido puede detectarse mediante PCR u otros métodos específicos para detectar ADN o ARN específicos. .
La separación magnética también se usa ampliamente en la industria del diagnóstico y puede lograr métodos de extracción de ácido nucleico automatizados y de alto rendimiento.
Los diferentes tipos de pruebas genéticas implicarán pasos de extracción y purificación de ácidos nucleicos. Entre los métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos, tanto el método líquido como el método de columna giratoria implican el uso de sustancias orgánicas tóxicas, que son dañinas para el medio ambiente y los operadores del experimento.
El método de perlas magnéticas requiere un tampón de perlas magnéticas especialmente formulado y perlas magnéticas especialmente modificadas. Desde los aspectos de costo y operación, ambos tienen altos costos y pasos de operación engorrosos. Al mismo tiempo, también limita el proceso de automatización y la promoción de aplicaciones. . Por lo tanto, el desarrollo de un método de liberación rápida de ácido nucleico que pueda liberar rápidamente ácido nucleico sin afectar los experimentos de pruebas genéticas posteriores se ha convertido en un problema urgente por resolver.
4. Tecnología de liberación rápida de ácidos nucleicos genéticos
El kit de liberación de ADN está dedicado a liberar rápidamente ADN amplificado por fluorescencia a temperatura constante de varias muestras comunes. Tiene las siguientes características:
1. El agente de liberación de ácido nucleico puede lisar rápidamente la muestra y liberar el ADN de la muestra en la solución. No es necesario preparar ningún reactivo usted mismo y no se utilizan reactivos tóxicos como fenol y cloroformo.
2. La operación es simple, solo se necesita un paso (aproximadamente 3 minutos) para obtener la plantilla de ADN para la amplificación de fluorescencia a temperatura constante, sin ningún paso de operación como centrifugación y extracción.
3. Todo el proceso se completa solo en un tubo de centrífuga, lo que evita la pérdida de muestras y no es fácil de contaminación cruzada. Es más simple y conveniente que los kits de extracción de uso común.
4. Amplia compatibilidad, adecuada para muestras de biología molecular comunes, incluidas bacterias, insectos, diversos tejidos animales, células orales, cabello, bacterias y virus en tejidos, etc.