¿Cuáles son los malentendidos comunes en el proceso de extracción de ácido nucleico con perlas magnéticas?
El uso de perlas magnéticas biológicas para la extracción de ácidos nucleicos sigue siendo un método de extracción de ácidos nucleicos relativamente nuevo en China. En comparación con el método tradicional de extracción de alcohol isoamílico con cloroformo y el método del kit de columna giratoria, muchas personas todavía comprenden este método. También hay algunos malentendidos en el proceso de usar perlas magnéticas para purificar ácidos nucleicos.
Malentendido 1: Cuantas más perlas magnéticas se utilicen, mejor será el efecto de extracción
A muchos profesores les gusta aumentar la cantidad de perlas magnéticas cuando el efecto de extracción no es bueno. Piensan que agregar un poco más de perlas magnéticas puede atraer más ácidos nucleicos. Debo decir que esta idea no es aconsejable.
La característica principal de las perlas magnéticas es que pueden dispersarse en un líquido o separarse de una fase líquida en un estado sólido bajo la acción de un campo magnético externo. Para cualquier sistema de reactivos, la proporción de perlas magnéticas a líquido debe tener un cierto umbral, superando una cierta proporción.Excesivas perlas magnéticas perderán sus características de dispersión porque no pueden dispersarse uniformemente en el líquido, y la eficiencia del contacto entre el ácido nucleico magnético. perlas y el líquido no se pueden aumentar completamente durante el proceso de lavado. Un exceso de perlas magnéticas también absorberá más impurezas, lo que tiene una gran influencia en el efecto de eliminación de impurezas. Incluso a veces, demasiadas perlas magnéticas adsorberán proteasa, lisozima y otros componentes funcionales que desempeñan un papel importante en el sistema líquido, lo que da como resultado una baja eficiencia de todo el kit. En muchos casos, cuando el efecto de extracción no es bueno, reducir la cantidad de perlas magnéticas utilizadas es la mejor manera de mejorar el efecto de extracción.
Normalmente, la cantidad de perlas magnéticas de referencia proporcionada por el kit del método de perlas magnéticas es ligeramente excesiva. Por lo tanto, a menudo no es necesario aumentar la cantidad de perlas magnéticas para mejorar la eficiencia de adsorción. Sin embargo, si se determina que el efecto de extracción no es causado por una cantidad insuficiente de perlas magnéticas, es posible mejorar el efecto de extracción aumentando la cantidad de perlas magnéticas dentro de un cierto rango.
Tomemos como ejemplo las perlas magnéticas de la serie GNT-02. Al extraer macromuestras (tejido vegetal, sangre total, etc.), la dosis habitual es de 10 ul / vez; al extraer muestras de trazas (como ADN libre de suero, hisopos bucales, etc.), perlas magnéticas La dosis es de 15 ~ 20 ul / vez. Si necesita exceder este uso, debe comunicarse con un ingeniero técnico.
Malentendido 2: cuantos más reactivos se utilicen, mejor será el efecto de extracción
¿El efecto de craqueo no es bueno? Agregue más tampón de lisis. ¿El efecto de lavado no es bueno? Agrega más detergente. Este es el pensamiento inercial de muchos clientes en el uso de kits.
Sin embargo, para el método de perlas magnéticas, cada aumento en el volumen de una parte del líquido reduce la probabilidad de más colisiones de perlas magnéticas, y la reducción de la probabilidad de colisiones de perlas magnéticas dará como resultado una caída significativa en la tasa de adsorción. Por lo tanto, en muchos casos, aunque la adición de solución de lisis y solución de lavado puede mejorar la lisis y mejorar el lavado, el núcleo de la extracción de perlas magnéticas es la eficacia de la adsorción de ácidos nucleicos por perlas magnéticas. No se puede garantizar la eficacia de la colisión de perlas magnéticas, pero no se puede garantizar la eficacia de la extracción de ácido nucleico. Sí, por lo que simplemente aumentar la cantidad de reactivos utilizados para mejorar el efecto de extracción puede no ser completamente efectivo.
Para el kit de ADN genómico de sangre completa GNT-B02, la solución de lisis general no debe exceder los 400 ul / vez y la solución de lavado no debe exceder los 500 ul / vez. Si el sistema realmente necesita amplificarse, la cantidad de perlas magnéticas y muestras también debe aumentarse en consecuencia. Esta amplificación no es necesariamente en proporciones iguales.
Malentendido 3: Cuantos más tiempos de lavado, mejor es el efecto de extracción
Cuando hay demasiadas impurezas en el ácido nucleico extraído, el usuario considerará lavarse varias veces para obtener un ácido nucleico más puro. El aumento del número de lavados conduce de hecho a la purificación de los ácidos nucleicos, pero considerando que cada lavado perderá una cierta cantidad de ácido nucleico y aumentará la posibilidad de fragmentación e hidrólisis del ácido nucleico, generalmente es apropiado controlar el número de lavados en 2 a 4 veces.
Para la serie de kits GNT, los tiempos de lavado de un solo kit de purificación son 2 veces, los tiempos de lavado de los kits de plantas y animales son 3 veces y los tiempos de lavado de los kits de sangre son 3 ~ 4 veces.
Malentendido 4: Cuantas más muestras se utilicen, mejor será el efecto de extracción
Cuando la muestra no está lo suficientemente fresca o el contenido de ácido nucleico en sí es bajo, el efecto de extracción de ácido nucleico a menudo no es bueno y muchos profesores usarán múltiples muestras para aumentar la cantidad de extracción de ácido nucleico.
Sin embargo, el simple aumento del volumen de muestreo de la muestra a veces puede introducir demasiadas impurezas, excediendo la capacidad de lisado del lisado y también reducir la eficiencia de extracción. Por lo tanto, no se recomienda simplemente aumentar el volumen de muestreo de la muestra para lograr el propósito de aumentar el volumen de extracción.
Si el volumen de extracción es demasiado bajo debido a un volumen de muestra insuficiente, se recomienda pasar por el paso de enriquecimiento o concentración antes de comenzar la extracción. O aumentar la integridad de la lisis y exponer más ácidos nucleicos también es una solución.
Malentendido 5: si un cierto tipo de cuenta magnética es bueno, debería ser eficaz en todas las pruebas
Hay muchos tipos de perlas magnéticas, diferentes tamaños de partículas, diferentes dispersiones, diferentes tiempos de respuesta magnética, diferentes matrices de base de recubrimiento, diferentes grupos funcionales modificados externos, diferentes densidades de recubrimiento y diferentes longitudes de brazos de grupos funcionales, que darán lugar a perlas magnéticas Las características varían muy.
Por lo tanto, los experimentos y sistemas a los que se adaptan las diferentes perlas magnéticas también son diferentes. Al igual que los reactivos para la extracción de ácidos nucleicos, las fórmulas no son exactamente las mismas y las propiedades de las perlas magnéticas que también se utilizan para la extracción de ácidos nucleicos no son exactamente las mismas.
Algunas perlas magnéticas muestran una mayor eficacia de adsorción en la extracción de ácido nucleico constante, y algunas perlas magnéticas son más adecuadas para la extracción de trazas de ácido nucleico. Algunas perlas magnéticas son adecuadas para sistemas de reactivos más ácidos, y algunas perlas magnéticas son adecuadas para sistemas de reactivos más alcalinos. Algunas perlas magnéticas tienen una buena capacidad de respuesta magnética pero una velocidad de asentamiento rápida, que es más adecuada para el extractor automático de varilla magnética; algunas perlas magnéticas tienen una velocidad de sedimentación lenta pero un tiempo de respuesta magnético prolongado, y son más adecuadas para el extractor automático tipo pipeta.
Rara vez existe un tipo de perlas magnéticas que se pueda aplicar a todas las situaciones experimentales. A excepción del kit fijo, en la mayoría de los casos, las perlas magnéticas y el sistema de reactivos deben ajustarse durante un cierto período de tiempo.
Malentendido 6: en comparación con un determinado kit, el efecto no es bueno, es decir, las cuentas magnéticas no son buenas
En el proceso de cribado de perlas magnéticas, muchos clientes simplemente reemplazan las perlas magnéticas con la misma cantidad bajo el sistema de reactivo maduro para comparar los efectos de las perlas magnéticas.
De esta manera, es fácil concluir que ciertas perlas magnéticas no son efectivas, pero de hecho, debido a que diferentes perlas magnéticas son adecuadas para diferentes sistemas y dosis, a menudo es necesario ajustarlas para obtener mejores resultados de extracción.
