Какие общие методы экстракции и очистки нуклеиновых кислот используются в диагностике in vitro?

Под диагностикой in vitro понимаются продукты и услуги, которые позволяют получать клиническую диагностическую информацию путем тестирования образцов человека (крови, биологических жидкостей, тканей и т. Д.) Вне человеческого тела для определения заболеваний или функций организма.

Одним из ключевых шагов при обнаружении образцов человека является очистка нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) в образце. Метод очистки нуклеиновой кислоты является важным фактором, влияющим на качество экстрагированной нуклеиновой кислоты, и только высококачественная нуклеиновая кислота может соответствовать различным последующим применениям.

Нуклеиновая кислота — основа молекулярной биологии, а экстракция нуклеиновой кислоты — это порог для обнаружения нуклеиновых кислот, и даже вся молекулярная промышленность не может обойти этот порог. Во многих случаях качество экстракции нуклеиновой кислоты из образца напрямую определяет достоверность результатов теста.

Базовые знания нуклеиновой кислоты

Нуклеиновая кислота подразделяется на дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК), среди которых РНК может быть разделена на рибосомную РНК (р-РНК), информационную РНК (м-РНК) и транспортную РНК (т-РНК) в соответствии с различными функциями.

ДНК в основном сосредоточена в ядре, митохондриях и хлоропластах, в то время как РНК в основном распределена в цитоплазме.

Зачем нужна экстракция нуклеиновых кислот

Экстракция нуклеиновой кислоты дает ответы на большое количество обширных исследований и применений, а полученная нуклеиновая кислота может использоваться различными способами. Точная цель исследования определяет тип экстрагируемой нуклеиновой кислоты; применение нуклеиновой кислоты часто влияет на выбор метода экстракции. Чтобы определить лучший метод исследования, необходимо иметь четкое представление о последующих применениях нуклеиновых кислот и любых потенциальных ограничениях, связанных с типом образца. Хотя метод лизиса клеток различается в зависимости от типа образца, основной принцип общей экстракции нуклеиновой кислоты остается неизменным: образцы клеток или тканей лизируются для удаления загрязнителей, не являющихся нуклеиновыми кислотами.

Принципы и требования экстракции и очистки нуклеиновых кислот

1. Обеспечить целостность первичной структуры нуклеиновой кислоты;

2. Устранение загрязнения от других молекул (например, устранение вмешательства РНК при извлечении ДНК);

3. Отсутствуют органические растворители и чрезмерно высокие концентрации ионов металлов, которые могут ингибировать ферменты в образцах нуклеиновых кислот;

4. Следует минимизировать загрязнение других биологических макромолекул, таких как белки, полисахариды и липидные молекулы;

5. Устранение загрязнения другими молекулами нуклеиновых кислот, например удаление РНК при извлечении молекул ДНК, и наоборот.

Общие методы экстракции и очистки нуклеиновых кислот

1. Метод экстракции фенолом и хлороформом.

Фенол и хлороформ используются для извлечения ДНК с использованием фенола в качестве денатурирующего агента. Повторная экстракция денатурирует белок. SDS (додецилсульфонат натрия) лизирует клеточную мембрану и переваривает белок, полипептид или небольшой пептид в присутствии протеиназы K и EDTA. Молекулы денатурируют и разрушают ядерный белок, освобождая ДНК от ядерного белка. При этом ДНК легко растворяется в воде, но не растворяется в органических растворителях. Поверхность белковых молекул имеет гидрофильные группы, которые также легко гидратируются, а на поверхности образуется гидратный слой, так что белковые молекулы могут плавно входить в водный раствор с образованием стабильного коллоидного раствора.

Когда существует органический раствор, коллоидная стабильность белка разрушается, денатурируется и осаждается. После центрифугирования органический растворитель находится на дне пробирки (органическая фаза), ДНК находится в верхней водной фазе, а белок осаждается между двумя фазами. Используя принцип экстракции, в соответствии с белковой нуклеиновой кислотой, растворенной в разных слоях реагента, наконечник пипетки расширяется в разные жидкие слои для извлечения необходимых компонентов, а очищенная нуклеиновая кислота получается после нескольких промывок.

Недостатком является то, что из-за использования фенола, хлороформа и других реагентов токсичность относительно высока, длительная работа оказывает большее влияние на здоровье персонала, скорость восстановления нуклеиновой кислоты низкая, а потери велики. Из-за большой операционной системы повторяемость работы разных экспериментаторов оставляет желать лучшего. , Это не способствует защите РНК и затрудняет выполнение операций по миниатюризации.

Преимущество заключается в том, что в лабораториях используются обычные реагенты и лекарства, а стоимость относительно невысока.

2. Очистка на спин-колонке.

В этом методе поверхность нуклеиновой кислоты покрывается тонкой пленкой, состоящей из молекул воды. В среде с высоким содержанием соли эта гидрофильная мембрана будет разрушена, так что нуклеиновая кислота может адсорбироваться на спин-колонке, в то время как другие примеси, такие как белок, продукты метаболизма и т. Д., Будут отделены от нуклеиновой кислоты осаждением на центрифуге.

Но даже в этом случае метод очистки на спин-колонке все же имеет недостатки:

(1) сильно зависит от связывающей способности адсорбционной мембраны;

(2) Неполное элюирование приводит к потере нуклеиновой кислоты;

(3) Нуклеиновую кислоту нельзя экстрагировать в больших количествах.

3. Метод магнитных шариков для технологии разделения нуклеиновых кислот.

Положительно заряженные магнитные шарики легко адсорбируют отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты и в основном используются для извлечения ДНК и РНК из образцов сыворотки или плазмы человека. Обычно образец смешивается с буфером для связывания и магнитными шариками. После объединения нуклеиновой кислоты с магнитными шариками она несколько раз промывается и захватывается магнитным полем. Элюированная нуклеиновая кислота может быть обнаружена с помощью ПЦР или других специфических методов для обнаружения специфической ДНК или РНК. .

Магнитная сепарация также широко используется в диагностической промышленности и позволяет достичь высокопроизводительных и автоматизированных методов экстракции нуклеиновых кислот.

Различные типы генетического тестирования будут включать этапы экстракции и очистки нуклеиновых кислот. Среди методов экстракции и очистки нуклеиновых кислот жидкий метод и метод спин-колонки предполагают использование токсичных органических веществ, которые вредны для окружающей среды и операторов экспериментов.

Метод магнитных шариков требует соответствующего специально разработанного буфера для магнитных шариков и специально модифицированных магнитных шариков. С точки зрения стоимости и эксплуатации, оба имеют высокую стоимость и обременительные операции. В то же время это также ограничивает процесс автоматизации и продвижение приложений. . Следовательно, разработка метода быстрого высвобождения нуклеиновой кислоты, который может быстро высвобождать нуклеиновую кислоту, не влияя на последующие эксперименты по генетическому тестированию, стала актуальной проблемой, которую необходимо решить.

4. Технология быстрого высвобождения генов и нуклеиновых кислот.

Набор для высвобождения ДНК предназначен для быстрого высвобождения амплифицированной ДНК с постоянной температурой флуоресценции из различных распространенных образцов. Он имеет следующие характеристики:

1. Средство, выделяющее нуклеиновую кислоту, может быстро лизировать образец и высвобождать ДНК образца в растворе. Нет необходимости готовить какие-либо реагенты самостоятельно, и не используются токсичные реагенты, такие как фенол и хлороформ.

2. Операция проста, требуется всего один шаг (около 3 минут), чтобы получить матрицу ДНК для амплификации флуоресценции при постоянной температуре, без каких-либо операций, таких как центрифугирование и экстракция.

3. Весь процесс выполняется только в одной центрифужной пробирке, что позволяет избежать потери следовых проб и затруднить перекрестное загрязнение. Это проще и удобнее, чем обычно используемые комплекты для извлечения.

4. Широкая совместимость, подходит для общих образцов молекулярной биологии, включая бактерии, насекомых, различные ткани животных, клетки полости рта, волосы, бактерии и вирусы в тканях и т. Д.